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O PNI abriga aproximadamente 5.000 espécies de insetos, 384 de aves e 50 de mamíferos, além de inúmeros répteis e anfíbios, muitas das quais endêmicas ou ameaçadas, como o sapo flamenguinho (Melanophryniscus moreirae), a onça parda ou suçuarana (Puma concolor), o macaco muriqui (Brachyteles hypoxanthus), entre outras.
As aves têm grande importância para a Unidade, tanto sob o ponto de vista ecológico, quanto pelo seu potencial turístico. O Parque Nacional é considerado um dos melhores locais do mundo para a prática do “birdwatching” ou observação de aves. Atualmente pelo menos 384 espécies são relatadas para o PNI, sendo 51 consideradas endêmicas (HONKALA & NIIRANEN, 2010) e 42 vivendo em altitudes elevadas (IBAMA, 1994)
Entre as espécies da flora, podemos destacar a araucária (Araucaria angustifolia), que tem nessa região sua ocorrência natural mais ao Norte em território brasileiro, as espécies endêmicas Piper itatiaianum, Itatiaia cleistopetala, Fernsea itatiaiae, além de inúmeras espécies características dos campos de altitude, inclusive rupícolas.