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Em meados do século XIX, Louis Pasteur propôs a teoria microbiana das doenças, na qual explicava que todas as doenças eram causadas e propagadas por algum “tipo de vida diminuta”, que multiplicava-se no organismo doente, transmitia-se para outro e o contaminava. Pasteur, no entanto, ao trabalhar com a raiva, constatou que, embora a doença fosse contagiosa e transmitida pela mordida de um animal raivoso, o micro-organismo não podia ser observado. Pasteur concluiu que o agente infeccioso estava presente mas era muito pequeno para ser observado através do microscópio.
Em 1884, o microbiologista Charles Chamberland desenvolveu um filtro (conhecido como filtro Chamberland ou Chamberland-Pasteur), com poros mais pequenos do que uma bactéria. Fazendo passar uma solução que continha bactérias através desse filtro, as bactérias ficavam nele retidas e a solução filtrada obtida tornava-se estéril.
Em 1886, Adolf Mayer demonstrou que a doença do tabaco podia ser transmitida a plantas saudáveis pela inoculação com extratos de plantas doentes.[9][10] Em 1892, o biólogo Dmitry Ivanovsky fez uso do filtro Chamberland para demonstrar que folhas de tabaco infectadas trituradas continuavam infectadas mesmo após a filtragem.
Ivanovsky sugeriu que a infecção poderia ser causada por uma toxina produzida pelas bactérias, mas ele não persistiu nesta hipótese.[13] Em 1898, o microbiologista Martinus Beijerinck repetiu a experiência independentemente e ficou convencido que a solução filtrada continha um novo agente infeccioso, denominado de contagium vivum fluidum (fluido vivo contagioso).Ele também observou que este agente apenas se reproduzia em células que se dividiam, mas não conseguiu determinar se este seria constituído de partículas, assumindo que os vírus estariam presentes no estado líquido.
Beijerinck introduziu o termo 'vírus' para indicar que o agente causal da doença do mosaico do tabaco não tinha uma natureza bacteriana, e sua descoberta é considerada como o marco inicial da virologia.[12] A teoria do estado líquido do agente foi questionada nos 25 anos seguintes, sendo descartada com o desenvolvimento de teste da placa por d'Herelle em 1917,[15][16] pela cristalização desenvolvida por Wendell Meredith Stanley em 1935[13][17] e pela primeira microfotografia eletrônica realizada em 1939 do vírus do mosaico do tabaco.
Em 1898, Friedrich Loeffler e Paul Frosch identificaram o primeiro agente filtrável de animais, o vírus da febre aftosa (Aphtovirus).[20] E em 1901, Walter Reed identificou o primeiro vírus humano, o vírus da febre amarela (Flavivirus). Em 1908, Vilhelm Ellerman e Olaf Bang demonstraram o potencial oncogênico de um agente filtrável, descobrindo o vírus da leucose aviária.E em 1911, Peyton Rous transmitiu um tumor maligno de uma galinha para outra, descobrindo o vírus do sarcoma de Rous, e demonstrando que o câncer poderia ser transmitido por um vírus.