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Um dos aspetos que chama mais a atenção na pintura é o equilíbrio entre o humano e o natural, expresso, por exemplo, pela forma como a ondulação dos cabelos da mulher parece ecoar nas águas do rio atrás dela. A harmonia entre os elementos parece ser simbolizada pelo sorriso de Mona Lisa. A pintura apresenta uma mulher sentada, mostrando apenas a parte superior do seu corpo; no fundo, uma paisagem que mistura a natureza (as águas, as montanhas) e a ação humana (os caminhos). O corpo da modelo surge numa estrutura piramidal: na base estão as suas mãos, no vértice superior o seu rosto. O sorriso ambíguo de Mona Lisa é, sem dúvida, o elemento do quadro que mais tem captado a atenção de quem o observa. Potenciou diversas leituras e teorias, inspirando textos, músicas, filmes, entre outros.
Vários estudos foram realizados para identificar o sentimento que está por trás do seu sorriso, incluindo alguns que utilizaram sistemas de computador que reconhecem emoções humanas através de fotografias. Contrastando com a imprecisão do seu sorriso, o olhar da mulher exibe uma expressão carregada de intensidade. A obra produz um efeito de ótica que resulta na impressão de que os olhos inquisitivos e penetrantes de Mona Lisa nos seguem, de todos os ângulos. Está sentada, com o braço esquerdo encostado no apoio da cadeira e mão direita pousada sobre a esquerda. A postura da modelo parece combinar algum conforto com solenidade e formalidade, deixando evidente que posa para o retrato.
No plano de fundo está uma paisagem imaginária, composta por montanhas com gelo, águas e caminhos feitos pelo Homem. Aquilo que mais se destaca é o fato de ser desigual, mais baixa do lado esquerdo e mais alta do lado direito.