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Em 1541, Gonzalo foi declarado governador de Quito. Não satisfeito e encorajado por Francisco Pizarro, ele conduziu uma expedição a leste de Quito com Francisco de Orellana em busca da fantasiosa cidade de Eldorado e do país da canela. Em Quito, Gonzalo conseguiu recrutar 220 espanhóis e 4 000 nativos americanos. O segundo-em-comando, Orellana, foi enviado a Guayaquil para recrutar mais tropas e cavalos. Gonzalo Pizarro e seus seguidores deixaram Quito em fevereiro de 1541, um mês antes de Orellana, que conseguiu trazer 23 homens e vários cavalos. Em março, eles se encontraram no vale de Zumaco e começaram sua marcha para cruzar os Andes. Depois de seguir os cursos dos rios Coca e Napo, a expedição começou a ficar sem provisões. Cerca de 140 dos 220 espanhóis morreram, assim como 3 000 dos 4 000 nativos. Em fevereiro de 1542, eles decidiram que Orellana continuaria descendo o rio Napo em busca de comida junto com 50 homens.
Depois de pouco tempo, Gonzalo achou que a expedição era um desastre total e decidiu tomar a rota a norte de volta a Quito com 80 dos homens restantes, sem perceber que abriu mão do sucesso para Orellana, que terminou descobrindo e explorando o rio Amazonas em toda a sua extensão.
Com seu retorno a Quito, Gonzalo descobriu que os almagristas (como os seguidores de Almagro foram chamados) tinham assassinado seu irmão Francisco Pizarro em 26 de junho de 1541 em retaliação à execução de Almagro. Por essa época, o representante da coroa, Cristóbal Vaca de Castro, chegou ao Peru em meio à confusão após a morte de Pizarro. Gonzalo Pizarro ofereceu ajuda para capturar os responsáveis pela morte de seu irmão, mas não foi aceita.